Su presencia y enumeración puede por tanto utilizarse en la práctica clínica como indicador de malignidad y pronóstico de la enfermedad. Sin embargo, el aislamiento de CTCs en sangre de pacientes de cáncer es complejo dado su reducido número (del orden de las decenas de CTCs por cada 10ml de sangre). Además, los métodos de aislamiento existentes no son específicos, o no son compatibles con la supervivencia o posterior expansión de las CTCs.
En este proyecto se propone, como objetivo general, el desarrollo de un sistema de aislamiento de CTCs basado en el uso de dispositivos microfluídicos. Concretamente, el sistema propuesto consiste en la combinación secuencial de un método de aislamiento basado en fuerzas inerciales (Módulo Inercial) y otro basado en las propiedades eléctricas de las células (Módulo Dielectrofóresis). Estos métodos permiten aislar las CTCs gracias a sus diferencias físicas respecto a eritrocitos, plaqueta, leucocitos y otras células de la sangre. Además, al ser métodos no letales para las células ni requerir el anclaje a las células de anticuerpos, permiten el posterior enriquecimiento y caracterización de las CTCs aisladas.
Durante la primera anualidad del proyecto se definieron las especificaciones para las dos etapas de aislamiento y se diseñaron los dispositivos microfluídicos apoyados en simulaciones numéricas.
Finalmente, se fabricaron los dispositivos utilizando como material un polímero transparente biocompatible (PDMS) y se realizaron pruebas de validación con microesferas para el módulo inercial y con células sanguíneas para el módulo de dielectrofóresis. Los resultados preliminares revelaron que, pese a ser funcionales, los dispositivos precisaban de ser optimizados para una correcta separación de las células de interés.
En la segunda anualidad, apoyados en los resultados experimentales previos y en la optimización de los modelos computacionales (simulaciones), se han diseñado nuevos dispositivos microfluídicos para ambas etapas de aislamiento, y se han elaborado nuevos diseños y estrategias para la etapa de dielectrofóresis. El trabajo realizado se describe en los siguientes párrafos.
El módulo inercial se ha rediseñado y optimizado, definiendo un diámetro de corte de separación de nueve micras, límite teórico por encima del cual se encuentran las CTCs. Para ello, se ha definido una subrutina de usuario que permite aplicar y cuantificar las fuerzas de sustentación y arrastre sobre las microesferas. De esta forma, puede seguirse de forma individualizada la trayectoria de cada una de ellas. Gracias a esta subrutina pudo redefinirse la configuración de ramas de salida del dispositivo para favorecer la separación de las microesferas por tamaño. Para validar el sistema, una vez fabricados los dispositivos en PDMS, se han utilizado microesferas fluorescentes de metacrilato de diferentes tamaños (6, 8 ,10, 12, 16 y 20 micras de diámetro), estudiado las salidas del módulo por medio de citometría de flujo. Los resultados revelan una eficiencia del 99% en el aislamiento de esferas de 10, 12, 16 y 20 micras, poblaciones por encima del diámetro de corte propuesto. Se ha observado también una contaminación en la muestra de salida del 35 % de las esferas de 8 micras, valor asumible debido a la incertidumbre experimental y a las diferencias normales entre el modelo experimental y el físico. Cabe destacar que sólo se ha detectado en las pruebas experimentales un valor promedio de un 4% de esferas de 6 micras en la muestra de salida. Este dato es significativo por ser este es el tamaño estimado de los eritrocitos, que equivalen al 95% del total de células presentes en la sangre. También se ha testado el módulo con sangre de ratón mezclada con líneas de células tumorales, con resultados satisfactorios. Por lo tanto, se puede concluir con que el diseño propuesto es funcional y garantiza una primera etapa de aislamiento rápido de CTCs que elimina casi en su totalidad las células pequeñas de la muestra.
El módulo de dielectrofóresis separa las CTCs, aprovechando las diferencias existentes en el fenotipo eléctrico de las CTCs respecto al fenotipo eléctrico de las demás células de la sangre. Para ello es necesario el uso de electrodos para generar un campo eléctrico que polarice las células que transitan por el canal microfluídico. A lo largo de la segunda anualidad, se han realizado pruebas con diferentes técnicas de fabricación de los electrodos, buscando un compromiso entre resolución y versatilidad de fabricación de los mismos. Además, los electrodos deben garantizar la viabilidad celular. Para ello, se debe asegurar que hay una capa de aislamiento entre los mismos y el canal por el que transitan las células. Tras diferentes pruebas realizadas, los electrodos se han fabricados mediante fotolitografía y los canales microfluídicos se han fabricado en PDMS mediante un proceso replica-molde. Estos canales se adhieren mediante pegado por plasma a los electrodos, formando un dispositivo integrado. Estos dispositivos integrados se han probado haciendo uso de una línea tumoral comercial de cáncer de pulmón. Los resultados preliminares revelan que el sistema es funcional, aunque se ha observado la pérdida de algunas células, factor crítico debido al reducido número de CTCs que existen en las muestras de pacientes. Esta pérdida está es debida a problemas con el alineamiento del canal en PDMS con los electrodos. Se continúa trabajando en esta etapa para optimizar el módulo de dielectrofóresis.
A lo largo de esta segunda anualidad, como ya se hiciese en la primera, se ha tenido en cuenta las especificaciones del dispositivo final integrado, con el fin de adaptar a ellas el diseño de las diferentes etapas microfluídicas anteriormente descritas. Gracias a ello, ha podido hacerse un dimensionado general de las conexiones y repositorios inter-módulos que se requerirán para garantizar el funcionamiento del sistema integrado.
En resumen, los resultados obtenidos durante las dos anualidades del proyecto son prometedores:
- i) el módulo de separación inercial ha sido validado con microesferas y con muestras de sangre de ratón mezclada con células tumorales, presentando un rendimiento elevado.
- ii) el módulo de dielectrofóresis, ha sido validado con células tumorales, y se han identificado sus principales debilidades para una futura optimización; iii) se han dimensionado los elementos necesarios para la integración final del dispositivo de aislamiento de CTCs. En este contexto, y ante el potencial de la herramienta propuesta, se pretende solicitar una continuación de este proyecto para: i) hacer pruebas de caracterización con sangre humana y sangre de pacientes con cáncer con el módulo inercial con el fin de confirmar que los dispositivos funcionaría también en clínica; ii) optimizar el módulo de dielectrofóresis y hacer pruebas de caracterización con sangre humana normal y sangre de pacientes con cáncer.
iii) una vez verificada la funcionalidad de las dos etapas principales, fabricar un dispositivo integrado y validar su utilidad clínica para detectar CTCs en sangre de pacientes con cáncer de pulmón.
