NOXFUN

Noxfun proiektua oxigenasa fungikoen in vitro ekoizpenera bideratu da.
Oxigenasak oxigeno-atomoak konposatu organiko ezberdinetara gaineratzeko prozesua katalizatzen duten entzima mota batzuk dira. Entzima horiek oso garrantzitsuak dira prozesu biologiko askotan, hormonen eta beste konposatu bioaktibo batzuen sintesia, toxinen degradazioa eta erantzun immunea barne. Proiektu honetan bi oxigenasa motari erreparatu diegu: polisakaridoen monooxignesasa litikoak (LPMO, Lytic Polysaccharide Monooxigenase izenekoaren ingelesezko ikurrak) eta lipooxigenasak.

LPMO izenekoak onddo, bakteria eta beste organismo batzuetan dauden oxidasa motak dira. Beren zeregin nagusia zelulosa eta zelula-horma begetalean dauden beste polisakarido batzuk degradatzea da. Ahalmen hori dela medio, bioerregaiak ekoizteko eta hondakin organikoak degradatzeko tresna entzimatiko modura aski ikertuak izan dira. Gainera, LPMO horiek, era berean, elikagaien ekoizpenean aplikatu daitezke eta industria-material batzuen propietateak hobetzeko erabil daitezke. Proiektu honetan, osasunaren esparruari begirako aplikazio berri bat ikertu da, entzima horiek zelulosa bidez eratutako bakterio-biofilmak degradatzeko.

Bestalde, lipooxigenasak organismo askotan dauden (gizakiak barne) oxigenasa mota dira. Entzima horiek gantz-azido poliasegabeak oxidatzen dituzte, hainbat produktu bioaktibo ekoizteko, esate baterako, leukotrienoak, lipoxinak eta hepoxilinak, erantzun immunean eta hanturan zeregin garrantzitsua betetzen dutenak. Gainera, lipooxigenasa batzuk minbiziaren eta beste gaixotasun batzuen garapenarekin lotu izan dira. Proiektu honetan onddo-jatorriko lipooxigenasen ekoizpena ikertu da, izan ere, onddoak entzima horien ekoizpenean gutxi ikertu diren organismo multzoa dira, eta fisiologian duten zeregina ez dago argi.
Organismo berrietatik abiatuz entzima berriak eskuratzea oso garrantzitsua da bioteknologiaren esparruan, izan ere, planetako organismo ezberdinetan dagoen entzima aldetiko aniztasunak aukera ugari eskain ditzake efizienteagoak, iraunkorragoak eta ingurumenari so hobeak izan daitezkeen prozesu bioteknologiko berriak hobetu edo garatzeari begira.

Ildo horretatik, Noxfun proiektuarekin, orokorki daudenez aparteko onddoen bidez ekoitzitako oxigenasa berri horiek bilatu ditugu. Horretarako, lehenik eta behin, interesekoak diren proteinetan nahi genituen ezaugarriak zehaztu genituen (erresistentzia tenperatura altuan, erresistentzia gazitasunaren aurrean), eta ondoren, ezaugarri horiekin ingurune naturaletan bizi ziren onddoak bilatu genituen (onddo termofiloak, gatzaren ondoriozko estresaren aurrean erresistenteak diren onddoak). Bilaketa hori sekuentziatutako genomadun onddoen datu-basean egin genuen (Mycocosm, de Joint Genome Institute). Horrela, intereseko proteinak kodetzen zituzten geneen sekuentzia eskuratu ahal izan genuen.

Prozesu horretan zehar, honako arrazoinamendu hau izan genuen: organismo konbentzional batek ekoitzitako proteina bat termoegonkortzen saiatu beharrean, organismo termofilo baten proteina araztea planteatu genuen. Horrela, tenperatura altu horretan, proteina horren egokitzapena bilakaera naturalean zehar gertatuko zen, laborategian bideratutako bilakaeran baino modu eraginkorragoan. Intereseko onddo extremofilora iristeko arazoa gainditu egin zen genearen sekuentzia izatean. Horri esker, mikroorganismo ekoizlea hazteko premia ekiditen zen.

Behin mikroorganismoa eta gena identifikatuta, intereseko LPMO eta lipooxigenasa ugariri zegozkion hainbat gene sintetizatu ziren in vitro. Sintesia egiteko, genearen sekuentzia optimizatu egin zen, Plichia pastoris legamia metilotrofikoa sistema heterologoan berau hobeto adierazteko. Legamia hori bioteknologian aski erabilia da berriro konbina daitezkeen proteinak adierazteko sistema gisa, proteina heterologoak kopuru handitan ekoizteko bere ahalmena dela medio.

Planteamendu horrekin, hasiera batean, 20 gene hautatu ziren, ikertu eta ekoizpen-prozesuari ekiteko. Horietatik sei hartu ziren lanketaren ardatz modura, sistema heterologoan adierazi zirenak eta, azkenik, 4 litroko hartzigailutan ekoizpenera eraman ziren bi LPMO-tan. Entzima horietan glikosilazio-sistema aztertu zen (izan ere, zelulaz aparteko entzimak ziren), bere jarduera entzimatikoa aztertzeko sistema bat prestatu zen, eta bere hiru dimentsioko egitura aztertu zen AlphaFold adimen artifizialeko plataforma erabiliz. Proteinaren egitura ezagutzeak eta entzima horietakoren baten funtzioa laborategian zehazteak (zeintzuen funtzioa soilik modu bioinformatikoan aurresan baitzen, eta ez esperimentalean), ekoizpen-prozedura hori industria -intereseko edo interes bioteknologikoko beste entzima batzuetan aplikatzeko aukera zabaltzen du.

Ondorio modura: Noxfun proiektuan zehar, hainbat entzima hautatu dira propietate bereziak dituzten entzimak sorrarazten dituzten ingurunetan bizitzeagatik hautatu ziren mikroorganismoak identifikatuz. Behin organismoak identifikatuta, entzima horiek kodetzeko geneak identifikatu ziren, eta gene horiek sintetizatu egin ziren laborategiko legamia batean adierazteko. Horrela, entzimak ekoitzi ahal izan ziren, hasierako mikroorganismo ekoizlearekin inolako kontakturik sekula izan gabe. Hainbatetan, entzima horiek beren jarduera entzimatikoa zehazteko adinako mailan ekoitzi ziren laborategian eta, modu osagarrian, beren egitura zehaztu zen. Horrela, produktu horien transferentzia ekoizpen-maila altuago batzuetara planteatzeko eta teknologia hori beste produktu berri batzuen bilaketan aplikatzeko aukera ematen duen maila bat erdietsi zen.