Horien agerpena eta zerrendaketa, beraz, praktika klinikoan gaixotasunaren gaiztotasunaren eta pronostikoaren adierazle gisa erabil daiteke. Hala ere, minbizia duten pazienteen odolean TZZak isolatzea konplexua da, gutxi baitira (dozenaka TZZ inguru 10 ml odoleko). Gainera, dauden isolamendu metodoak ez dira espezifikoak, edo ez dira bateragarriak TZZen biziraupenarekin edo ondorengo hedapenarekin.
Proiektu honetan, helburu orokor gisa, TZZak isolatzeko sistema bat (gailu mikrofluidikoen erabileran oinarritutakoa) garatzea proposatzen da. Zehazki, proposaturiko sistema indar inertzialetan oinarritutako isolamendu-metodo baten (modulu inertziala) eta zelulen propietate elektrikoetan oinarritutako beste baten (dielektroforesi modulua) konbinazio sekuentzialean oinarritzen da. Metodo horiek TZZak isolatzeko aukera ematen dute, eritrozitoei, plaketari, leukozitoei eta odoleko beste zelula batzuei dagokienez dituzten desberdintasun fisikoei esker. Gainera, metodo ez-hilgarriak direnez zelulentzat eta antigorputzen zeluletara ainguratzea eskatzen ez dutenez, ondoren TZZ isolatuak aberastu eta ezaugarritzeko aukera ematen dute.
Proiektuaren lehen urtean, isolamenduaren bi etapetarako zehaztapenak definitu ziren, eta zenbakizko simulazioetan oinarritutako gailu mikrofluidikoak diseinatu ziren.
Azkenik, material gisa polimero garden biobateragarri bat (PDMS) erabiliz fabrikatu ziren gailuak, eta baliozkotze-probak egin ziren mikroesferekin modulu inertzialerako eta odol-zelulekin dielektroforesi modulurako. Aurretiazko emaitzek erakutsi zuten, funtzionalak izan arren, gailuak optimizatu egin behar zirela intereseko zelulak behar bezala bereizteko.
Bigarren urtean, aurreko emaitza esperimentaletan eta eredu konputazionalen (simulazioak) optimizazioan oinarrituta, gailu mikrofluidiko berriak diseinatu dira isolamenduko bi etapetarako; eta diseinu eta estrategia berriak prestatu dira dielektroforesiaren etaparako. Egindako lana hurrengo paragrafoetan deskribatzen da.
Modulu inertziala berriro diseinatu eta optimizatu egin da; eta bederatzi mikrako bereizteko ebaketa diametro bat zehaztu da (muga teoriko horren gainetik daude TZZak). Horretarako, erabiltzaile azpirrutina bat definitu da; mikroesferetan euste- eta arraste-indarrak aplikatu eta kuantifikatzeko aukera ematen du. Horrela, banaka jarrai daiteke bakoitzaren ibilbidea. Azpirrutina horri esker, berriz definitu ahal izan zen gailuko irteera-adarren konfigurazioa, mikroesferak tamainaren arabera bereizten laguntzeko. Sistema baliozkotzeko, gailuak PDMSz fabrikatu ondoren, hainbat neurritako (6, 8, 10, 12, 16 eta 20 mikrako diametrokoak) metakrilatozko mikroesfera fluoreszenteak erabili dira, eta moduluko irteerak fluxu-zitometria bidez aztertu dira. Emaitzek % 99ko eraginkortasuna erakusten dute 10, 12, 16 eta 20 mikrako esferen isolamenduan (proposatutako ebaketa diametrotik gorako populazioak). Irteera-laginean 8 mikrako esferen % 35eko kutsadura ere hauteman da. Balio hori onargarria da ziurgabetasun esperimentalaren eta eredu esperimentalaren eta fisikoaren arteko ezberdintasun normalen ondorioz. Nabarmentzekoa da proba esperimentaletan bakarrik hauteman dela 6 mikrako esferen % 4ko batez besteko balioa irteera-laginean. Datu hori adierazgarria da, hori baita eritrozitoen tamaina zenbatetsia (odolean dauden zelula guztien % 95 dira). Halaber, modulua tumore-zelulen lerroekin nahastutako sagu-odolarekin testatu da, eta emaitza onak lortu dira. Beraz, ondoriozta daiteke proposatutako diseinua funtzionala dela; eta TZZen isolamendu azkarreko lehen etapa bat bermatzen duela, lagineko zelula txiki ia guztiak desagerrarazten dituena.
Dielektroforesi moduluak TZZak bereizten ditu, TZZen fenotipo elektrikoan odoleko gainerako zelulen fenotipo elektrikoarekin alderatuta dauden aldeak aprobetxatuz. Horretarako, elektrodoak erabili behar dira kanal mikrofluidikotik igarotzen diren zelulak polarizatuko dituen eremu elektrikoa sortzeko. Bigarren urtean zehar, elektrodoak egiteko teknikekin probak egin dira, eta horien erresoluzioaren eta fabrikatzeko moldakortasunaren arteko konpromisoa bilatu da. Gainera, elektrodoek zelulen bideragarritasuna bermatu behar dute. Horretarako, ziurtatu behar da isolamendu-geruza bat dagoela horien eta zelulak igarotzen diren kanalaren artean. Hainbat proba egin ondoren, elektrodoak fotolitografiaren bidez egin dira, eta kanal mikrofluidikoak PDMSz fabrikatu dira erreplika-molde prozesu baten bidez. Kanal horiek plasma bidez itsatsita atxikitzen zaizkie elektrodoei, eta gailu integratu bat sortzen dute. Gailu integratu horiek biriketako minbiziaren tumore-lerro komertzial bat erabiliz probatu dira. Aurretiazko emaitzek erakusten dute sistema funtzionala dela, baina ikusi da zenbait zelula galdu egin direla (eta faktore kritikoa da hori, pazienteen laginetan dauden TZZen kopurua txikia baita). Galera hori PDMSz egindako kanala elektrodoekin lerrokatzean gertaturiko arazoengatik da. Etapa honetan dielektroforesi modulua optimizatzeko lanean jarraitzen da.
Bigarren urte honetan, lehenengoan egin bezala, azken gailu integratuaren zehaztapenak hartu dira kontuan, arestian deskribatutako etapa mikrofluidikoen diseinua haietara egokitzeko. Horri esker, sistema integratuaren funtzionamendua bermatzeko beharko diren modulu arteko konexioen eta gordailuen neurri orokorrak ezarri ahal izan dira.
Laburbilduz, proiektuaren bi urteetan lortutako emaitzak esperantzagarriak dira:
i) bereizte inertzialaren modulua mikroesferekin eta tumore-zelulekin nahastutako sagu-odolaren laginekin baliozkotu da, eta errendimendu handia izan du.
ii) dielektroforesi-modulua tumore-zelulekin baliozkotu da, eta haren ahulezia nagusiak identifikatu dira, etorkizunean optimizatzeko; iii) TZZak isolatzeko gailuaren azken integraziorako beharrezko elementuak dimentsionatu dira. Testuinguru horretan, eta proposatutako tresnaren ahalmenaren aurrean, proiektu honen jarraipena eskatu nahi da honako hauetarako: i) modulu inertzialarekin giza odolarekin eta minbizia duten pazienteen odolarekin karakterizazio-probak egiteko, gailuek klinikan ere funtzionatuko luketela egiaztatzeko; ii) dielektroforesi modulua optimizatzeko eta karakterizazio-probak egiteko giza odol normalarekin eta minbizia duten pazienteen odolarekin.
iii) bi etapa nagusien funtzionaltasuna egiaztatu ondoren, gailu integratu bat fabrikatzeko eta haren erabilgarritasun klinikoa baliozkotzeko, biriketako minbizia duten pazienteen odolean TZZak hautemateko.
