Identificación de dianas terapéuticas para la enfermedad de Parkinson basadas en la interacción de una neuroinflamación y la expresión de sinucleína.
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La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno neurodegenerativo que no tiene cura cuyo principal factor de riesgo es la edad. Con el aumento de la esperanza de vida se prevé que en los próximos años aumente el número de personas afectadas por esta enfermedad. Los rasgos histopatológicos característicos de la EP son la degeneración de las neuronas dopaminérgicas de la vía nigroestriatal, la acumulación de alfa-sinucleína (aSin) y la presencia de una reacción neuroinflamatoria. La degeneración de las neuronas dopaminérgicas produce una disminución en los niveles del neurotransmisor dopamina que genera los síntomas motores típicos de la enfermedad y otros síntomas no motores muy frecuentes. Desde que se descubrió en los años 60, la levodopa sigue siendo la opción terapéutica más eficaz. Los tratamientos actuales van dirigidos a paliar el déficit dopaminérgico para mejorar la sintomatología motora, pero no son capaces de frenar el proceso neurodegenerativo que está en marcha. Por lo tanto, uno de los grandes retos en la investigación en la EP es el desarrollo de terapias que protejan las neuronas dopaminérgicas y permitan detener el curso de la enfermedad.
En este contexto, SinPARK propone el desarrollo de terapias innovadoras de neuroprotección para el tratamiento de la EP basadas en la modulación de la respuesta neuroinflamatoria y la conectividad neuronal. Concretamente, en este proyecto se han estudiado mecanismos de
neuroinflamación mediados por linfocitos y células gliales y mecanismos tóxicos dependientes de alfa-sinucleína en terminales sinápticas. Nuestra aproximación metodológica utiliza modelos representativos tanto de las formas esporádicas (90-95% de los casos) como familiares
(mutaciones de aSin) (5-10%) de la EP. A partir de las regiones afectadas por la degeneración dopaminérgica, somos capaces de aislar las células de la glía y los linfocitos para estudiar el perfil neuroinflamatorio utilizando técnicas de secuenciación y de citometría de flujo. Los resultados obtenidos se validan mediante técnicas histológicas. El análisis de los estados de activación de las células gliales en los distintos modelos experimentales muestra un perfil heterogéneo de activación diferente en cada modelo, lo que sugiere que a lo largo del proceso neurodegenerativo podría haber distintos estados de activación de la glía en función de la etapa. En los modelos que reflejan una fase activa del proceso neurodegenerativo, la microglía tiene un perfil fagocítico y antiinflamatorio, mientras que en el modelo crónico presenta un perfil pro-inflamatorio. En cambio, la activación de los astrocitos en el mesencéfalo muestra un patrón de activación homogéneo y claramente pro-inflamatorio en todos los modelos, pero heterogéneo en el estriado. Estos datos indican que en la fase aguda de la muerte neuronal se genera un tipo de reacción inflamatoria que varía cuando se cronifica la neurodegeneración. Por lo tanto, de cara a diseñar estrategias de neuroprotección es necesario determinar cuál es la diana y el tipo actividad inflamatoria que se pretende modular. El análisis de la infiltración de linfocitos y su estado de activación, nuevamente nos muestra cómo hay una gran variabilidad en función del modelo en el mesencéfalo, pero el tipo de infiltración es similar en el estriado. Un rasgo común que nos llamó la atención fue el aumento de la infiltración de las células T reguladores (Treg) en el mesencéfalo en los modelos que presentan una muerte neuronal activa. Por ello, decidimos eliminar selectivamente esta población utilizando animales transgénicos y analizar las consecuencias sobre la degeneración dopaminérgica. La depleción de las células Treg resultó neuroprotectora en los dos modelos experimentales estudiados. Nuestros datos sugieren que el mecanismo podría ser a través del bloqueo de la entrada de linfocitos T CD4, de células mieloides o la disminución en la producción
de TNFα.
La proteína aSin se localiza en las terminales dopaminérgicas y su malplegamiento y posterior agregación constituye un rasgo neuropatológico tanto de las formas esporádicas como familiares de la enfermedad y uno de los posibles mecanismos de muerte neuronal. En esto proyecto hemos investigado cómo cambian las interacciones que establece la aSin en los estadios iniciales de su acumulación. Para ello se ha desarrollado una metodología de biotinilización por proximidad in vivo (en ratones) que a permitido marcar las proteínas que interaccionan con la aSin con biotina. Las proteínas biotiniladas se han podido purificar a partir del mesencéfalo y del estriado y se han
identificado por espectrometría de masas. De esta manera se ha podido identificar un interactoma específico para aSin dependiente de localización subcelular, diferencial entre las terminales presinápticas estriatales y los somas dopaminérgicos de la SN. A partir de estos resultados es posible evaluar la relevancia de estos candidatos en relación a la pérdida de conectividad sináptica.
Una de las grandes preguntas en el ámbito de las sinucleinopatías es si se pueden transmitir célula a célula a través del sistema nervioso. Para contestar a esta pregunta nos hemos propuesto un reto tecnológico: diseñar y administrar virus en la SNpc capaces de expresar la aSin fusionada a la proteína fluorescente mCherry de manera que se pueda trazar la expresión de aSin en distintas regiones del cerebro y tipos celulares mediante citometría de flujo. En este proyecto hemos construido dichas herramientas y las hemos probado en ratón. Mediante citometría de flujo hemos sido capaces de detectar la proteína fusionada localizada en las terminales dopaminérgicas del estriado en astrocitos y microglía, pero no en oligodendrocitos o neuronas. Mediante técnicas histológicas estamos validando estos hallazgos.
