Identificación , producción y aplicación biotecnológica de nuevas oxigenasas de origen fúngico.
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El proyecto Noxfun ha estado dirigido a la producción in vitro de nuevas oxidasas fúngicas.
Las oxigenasas son un tipo de enzimas que cataliza la incorporación de átomos de oxígeno a diferentes compuestos orgánicos. Estas enzimas son muy importantes en muchos procesos biológicos, incluyendo la síntesis de hormonas y otros compuestos bioactivos, la degradación de toxinas y la respuesta inmune. En este proyecto, nos hemos centrado en dos tipos de oxigenasas, las monooxignesasas líticas de polisacáridos (LPMO, iniciales en inglés de Lytic Polysaccharide Monooxigenase) y las lipooxigenasas.
Las LPMO son un tipo de oxidasas que se encuentra en hongos, bacterias y otros organismos. Su principal función es degradar celulosa y otros polisacáridos presentes en la pared celular vegetal. Por esta capacidad, han sido muy estudiadas como una herramienta enzimática en la producción de la producción de biocombustibles y en la degradación de residuos orgánicos. Además, las LPMO también pueden tener aplicaciones en la producción de alimentos y en la mejora de las propiedades de algunos materiales industriales. En este proyecto, se ha estudiado una nueva aplicación en campo de la salud usando estas enzimas para la degradación de biopelículas bacterianas formadas por celulosa.
Por su parte, las lipooxigenasas son otro tipo de oxidasas que se encuentran en muchos organismos, incluyendo los humanos. Estas enzimas oxidan ácidos grasos poliinsaturados para producir diferentes productos bioactivos, como leucotrienos, lipoxinas y hepoxilinas, que desempeñan un papel importante en la respuesta inmune y en la inflamación. Además, algunas lipooxigenasas también se han relacionado con el desarrollo del cáncer y de otras enfermedades. En este proyecto se ha estudiado la producción de lipooxigenasas de origen fúngico porque los hongos son un grupo de organismos poco explorado en la producción de estas enzimas cuyo papel en su fisiología no está claro.
La obtención de nuevas enzimas a partir de nuevos organismos es de gran importancia para la biotecnología debido a que la diversidad enzimática presente en los diferentes organismos del planeta puede ofrecer una amplia variedad de opciones para mejorar o desarrollar nuevos procesos biotecnológicos que sean más eficientes, sostenibles y amigables con el medio ambiente.
En este sentido, en Noxfun hemos buscado estas nuevas oxigenasas producidas por hongos diferentes de los disponibles generalmente. Para ello, determinamos, en primer lugar, las características que deseábamos en la proteína de interés (resistencia a lata temperatura, resistencia a salinidad) y a continuación buscamos hongos que vivieran en ambientes naturales que seleccionaran dichas características (hongos termófilos, hongos resistentes a estrés salino). Esta búsqueda la hicimos en la base de datos de hongos cuyo genoma ha sido secuenciado (Mycocosm, de Joint Genome Institute). De esta forma tuvimos acceso a la secuencia de los genes que codificaban las proteínas de interés.
En este proceso, nuestro razonamiento fue el siguiente: en vez de intentar termoestabilizar una proteína producida por un organismo convencional, nos planteamos purificar la proteína de un organismo termófilo de forma que la adaptación de la proteína a esta alta temperatura se habría producido durante la evolución natural de forma más efectiva que la evolución dirigida en el laboratorio. El problema del acceso al hongo extremófilo de interés se solventaba al disponer de la secuencia del gen, lo que evitaba la necesidad de cultivar el microorganismo productor.
Una vez identificado el microorganismo y el gen, se sintetizaron in vitro varios genes correspondientes a varias LPMOs y lipooxigenasas de interés. La síntesis se hizo optimizando la secuencia del gen para lograr una mayor expresión del mismo en el sistema heterólogo de Plichia pastoris, una levadura metilotrófica muy usada en biotecnología como sistema de expresión de proteínas recombinantes debido a su capacidad para producir grandes cantidades de proteínas heterólogas.
Con este planteamiento se seleccionaron inicialmente 20 genes para estudiar e iniciar el proceso de producción. De ellos el trabajo se centró en seis que fueron expresados en el sistema heterólogo y, finalmente, en dos LPMOs que fueron llevadas a la producción en fermentadores de 4 litros. En estas enzimas se estudió el sistema de glicosilación ya que se trataba de enzimas extracelulares, se puso a punto un sistema de análisis de su actividad enzimática y se estudió su estructura tridimensional usando la plataforma de inteligencia artificial AlphaFold. El conocimiento de la estuctura de la proteína y la determinación a nivel de laboratorio de la función de alguna de estas enzimas cuya función había sido predicha únicamente de forma bioinformática y no experimental abren la posibilidad de aplicar este procedimiento de producción a otras enzimas con interés industrial o biotecnológico.
En conclusión: durante Noxfun se ha seleccionado varias enzimas mediante la identificación de los microorganismos que se seleccionaron por vivir en los ambientes en los que producen enzimas con propiedades especiales, una vez identificados los organismos, se identificaron los genes codificantes de esas enzimas y se sintetizaron dichos genes para expresarlos en una levadura de laboratorio con lo que fue posible producir las enzimas sin haber tenido nunca contacto con el microorganismos productor inicial. En varios casos, estas enzimas se produjeron en el laboratorio a un nivel suficiente como para determinar su actividad enzimática y, complementariamente, se determinó su estructura, con lo que se alcanzó un nivel en el que es posible plantearse la transferencia de estos productos a niveles de producción más elevados y aplicar esta tecnología a la búsqueda de otros nuevos productos.
